龙8国际头号玩家单细胞转录组与普通转录组关联的优势在上期推文《低投入，高性价比的发文策略---两种转录组关联分析思路》中已经有详细介绍。两组学关联的优势如下：

　　上期推文我们还提到普通转录组的样本前处理有两种处理方式，一种是流式分选或者激光显微切割（LCM）对细胞类型或组织区域进行普通转录组测序，另一种是对整体组织样本进行普通转录组测序，所以这期推文我们将分开介绍两种前处理的普通转录组如何与单细胞转录组进行关联分析，本期主要介绍流式或LCM样本的普通转录组与单细胞转录组关联的分析内容、应用思路和案例应用。

　　流式或LCM样本具体是对某个细胞类型或者亚型区域的样本进行普通转录组测序（bulk RNA-seq），所以该方法得到的测序数据就是代表单个细胞类型或者组织区域的基因表达特征数据，所以普通转录组与单细胞转录组测序（scRNA-seq）数据的关联分析主要就是结果的相互验证和双维度的诠释细胞/基因的表达机制。

　　由于bulk RNA-seq的本质就是细胞的表达量数据，所以我们可以将scRNA-seq的亚群与bulk RNA的样本放在一起进行两组学的相关性分析，如果相关性越高龙8国际头号玩家，说明scRNA-seq与bulk RNA-seq越具有相似性，说明可以用scRNA-seq进行单细胞分辨率的数据挖掘，为单细胞数据能够反映细胞特征的分辨率做可靠性验证。同时也可以根据亚群和bulk样本的相关性做单细胞数据的细胞注释或者验证注释结果的准确性。

　　由于单细胞转录组是针对细胞的高分辨率和基因低覆盖度的转录组技术，而普通转录组是针对样本整体和基因高覆盖度的转录组技术，所以我们可以将单细胞亚群筛选出来的亚群特征基因放在高测序深度的bulk样本中查看亚群特征基因的表达量高低，从而在两种转录组测序数据中双维度的验证亚群基因的特异性或者高表达量，为揭示单细胞分辨率下的基因挖掘和结果验证提供思路，从而达到两组学优势互补的目的。

　　适用于流式或LMD关联的应用思路核心是对目标细胞类型进行深入解析和验证。细胞图谱可以通过细胞类型频率分析发现目标细胞亚群，这是我们可以通过流式分选进行bulk RNA-seq，进而对目标细胞类型进行从细胞到基因特征的研究。另一种思路是已经有了目标细胞类型，可以同时进行单细胞和普通转录组的测序，然后通过相关性分析对单细胞注释和bulk RNA-seq计算相关系数，这是一种验证单细胞注释的可靠方法和思路。最后有了目标细胞类型后，我们也可以对细胞类型的关键基因在bulk RNA-seq中查看表达量高低，多一种方式验证结果的可靠性。

　　棉籽色素腺及其内含物棉酚的存在限制了棉籽的综合利用。理想的棉花种子没有腺体，但植株有腺体，只有少数澳大利亚野生棉花品种有这种特征，包括比克棉(Gossypium bickii)。这一性状已被证明很难渗入栽培物种。了解色素腺形态发生的生物学过程及其分子机制，将有助于培育具有无腺体和有腺体性状的棉花栽培品种。

　　比克棉子叶色素腺发育延迟，在棉籽利用和抗压改良方面具有重要的育种价值，是研究棉花色素腺形态发生的理想材料。因此，本文的关联分析解析了棉花色素腺形态发生的生物学过程以及调控色素腺形态延迟性状的分子机制。

　　对棉花子叶的单细胞转录组数据进行质控、聚类和分群后获得14个亚群。通过拟南芥的已知marker基因进行细胞注释，结果获得8种细胞类型，分别是叶肉细胞(mesophyll cell)、色素腺细胞(pigment gland cell)、表皮细胞(epidermal cell)、保卫细胞(guard cell)、木质部细胞(xylem cell)、原形成层细胞(procambium cell)、韧皮部薄壁细胞(phloem parenchyma cell)和伴随细胞(companion cell)。色素腺细胞中的前10个marker基因在bulk RNA-seq的有无腺体中有显著性的差异，与有腺体的bulk样本相比，无腺体中的大部分色素腺细胞标志基因显著下调，说明scRNA-seq中的色素腺细胞质量较好以及验证了细胞注释的准确性。

　　PG细胞再分群鉴定了3个亚群，分别是色素腺实质细胞、分泌细胞、凋亡细胞。为了进一步阐明色素腺的发育模式，本文分析了三种色素腺细胞的连续分化轨迹。发育轨迹从薄壁细胞亚群细胞开始，经过一个标志发育状态转变的分岔点后，一部分薄壁细胞逐渐分化为分泌细胞，并且筛选了发育轨迹中的差异基因。

　　在bulk RNA-seq中（种子吸胀后的5个阶段），前5个亚群标记基因的表达模式随着萌发而增加，并且分泌细胞和凋亡细胞的标记基因在0和12h不表达，说明与子叶色素腺的发育一致，证实了再分群和拟时分析的准确性。

　　根据前人结果和DAP-seq，挖掘了与GoPGF共表达的基因，来缩小参与调控色素腺发育的靶基因列表。整合DAP和scRNA结果，建立了GoPGF的靶基因调控网络。

　　从bulk RNA-seq中分析了这些TF的表达模式，结果发现TF的表达量都随萌发而增加，证实了从scRNA中色素腺形成和发育的模型。

　　1. 文章的单细胞数量不多，12222个细胞研究了棉花色素腺的形成和发育，并且发表在了Molecular Plant上，其文章特色是每一步都结合了bulk RNA-seq在萌发不同时期的表达模式，进一步证实了scRNA-seq挖掘结果的准确性，是一篇非常好的非模式植物单细胞+普通转录组的经典案例。

　　2. 关键节点的scRNA-seq+不同发育时间的bulk RNA-seq的研究策略不仅可以验证结果的可靠性，还可以使用bulk RNA-seq数据挖掘与表型相关的基因，从研究策略看是非常完美的，从性价比上讲是经济实惠的。

　　1. 少单细胞样本，多普通转录组样本的发文策略，既可以压低成本，又可以高效实惠的发表高分文章。

　　2. 弥补单细胞测序深度低的缺陷，每一步分析结果都可以将单细胞筛选的关键基因放在bulk样本中验证表达量高低，包含拟时分析和转录因子的关键基因都可以验证，增加结果的可靠性，是发表高分文章的一种经济实惠的策略。