龙8头号玩家近年来，绿色、可持续的皮克林界面生物催化（Pickering interface biocatalysis，PIB）技术已成为级联生物转化的研究热点，这一技术通常利用不同载体将酶固定在Pickering乳液界面，从而实以疏水化合物为底物的界面生物催化。此外，具有两亲性的酶-聚合物缀合物（enzyme-polymer conjugates）也可直接作为乳化剂制备Pickering乳液，它们既起到稳定乳液作用，也能在界面上实现较高的催化效率。但是利用传统方法制备酶-聚合物时，其偶联位点存在非特异性和不可控性等问题龙8国际头号玩家，这会导致酶功能受损，影响酶的催化活性。另外，在构建级联生物催化时，多种酶的体内表达纯化也使得整个过程费时费力。为了克服上述问题，上海科技大学李健与南丹麦大学吴昌柱课题组进行合作，实现了精准位点的酶-聚合物的可控制备，同时利用无细胞系统实现了不同酶的快速表达与级联催化途径的构建，为高值化学品的绿色合成提供了新方法。

　　研究人员选取苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase龙8国际头号玩家，BAL）为骨架酶蛋白，聚苯乙烯（polystyrene，PS）为高分子聚合物，以此二者做为材料制备酶-聚合物缀合物，并与无细胞表达体系结合制备乳液，进行界面的级联生物催化（图1）。这一过程由三步方案来实现，首先，利用E. coli表达并纯化BAL蛋白的突变体（BAL_A2B），即在其2号氨基酸位点引入非天然氨基酸（BibaF，B），做为与PS耦合的诱发位点。其次，通过原子转移自由基聚合反应（ATRP）将PS与BAL在BibaF位点进行耦合。最后，在最适的反应条件下，利用酶-聚合物（BAL_A2B-PS）与无细胞表达体系混合制备Pickering乳液，实现界面的级联生物转化。

　　研究人员首先对蛋白突变体BAL_A2B进行了表征（图2），结果显示，非天然氨基酸BibaF能够成功插入BAL，并保留了超过82%的野生型酶的活性，这为后续ATRP聚合反应制备酶-聚合物缀合物奠定了基础。

　　然后，作者以BAL_A2B为骨架蛋白，制备出三种不同的BAL_A2B-PS缀合物，并对其进行了结构表征与活力检测（图3）。结果表明，BAL_A2B与PS耦合成功，并很好地维持了蛋白质的二级结构。BAL_A2B-PS由于其侧链聚合物的疏水作用，导致缀合物有一定程度的聚集，间接验证了BAL_A2B与PS的成功耦合。酶活检测表明所有三种BAL_A2B-PS缀合物都保留了较高的催化活性，这为后续的界面催化提供了可能。

　　随后，作者利用BAL_A2B-PS制备Pickering乳液，并对其催化性能进行了检测（图4）。结果表明，以BAL_A2B-PS为乳化剂可制备出稳定的水包油型乳液，且乳液具备良好的、稳定的界面催化活性。结果显示，酶-聚合物在液滴（droplet）表面的覆盖率越高，越有利于Pickering界面催化。因此，作者选择了BAL_A2B-PS200、水油比（w/o）比为5:5、缀合物浓度为50 μM时制备的乳液进行后续酶促级联反应。

　　最后，作者将无细胞蛋白表达体系引入乳液水相，并对无细胞体系在乳液中的表达能力进行了表征（图5）。结果显示，该体系可对不同酶进行快速表达，这些酶无需纯化，即可原位与乳液界面上的BAL酶进行级联催化，可将级联反应效率整体提升5倍以上，实现了目标产物的高效合成。

　　综上，本研究构建的体系具有以下主要优势，一是克服了传统方法制备酶-聚合物时对酶活的损害，而在酶特定位点的精准耦合能够最大程度地保护酶活性；二是无需对酶进行体内表达与纯化，所采用的无细胞蛋白表达体系可以灵活快速地按需合成目的酶，实现原位级联催化；三是体系综合了PIB界面催化、蛋白精准修饰和无细胞表达等技术优势，为构建高效的生物级联转化用于合成高价值化合物提供了新思路。

　　上述研究成果近日发表于Angewandte Chemie International Edition，上海科技大学物质学院博士研究生卢皓凡为论文第一作者，上海科技大学李健教授和南丹麦大学吴昌柱教授为论文共同通讯作者，上海科技大学为第一完成单位。