Multi-layered computational gene networks by engineered tristate logics首次利用“三态门”电路/逻辑来设计基因线路的策略（TriLoS），为细胞编写“代码”，使其能够开展智能生物计算和细胞疗法。研究提出TriLoS设计理念，以“三态门”为基本逻辑单元，成功升级了生物计算的“编辑语言”，使设计哺乳动物细胞计算的 “基因软件”能够真正意义上在单细胞水平实现模块化、逻辑最简化和工程化编写细胞复杂逻辑计算电路；此外将“生物计算机”的概念应用于复杂代谢性疾病的治疗，使细胞可以根据疾病不同状态及时启动不同的定制化治疗程序。这项工作对现代智能生物计算的发展及其在精准医疗领域的应用具有重要意义。

　　细胞犹如微型计算机，每时每秒都在接收、转导和处理内的不同信息，并通过细胞内高效并行的信号转导途径来做出极快的响应，生成指令信号，指导自身或周围细胞开始新一轮的计算。如何让功能强大的细胞听懂人类的指令，开展复杂的信息处理和计算功能？如何定制出不同的“应用程序(APP)”，像编辑计算机一样调控细胞的功能？从本世纪初，合成生物学家大胆尝试利用人工基因线”布尔计算逻辑。计算机主要是通过控制高、低电平，即代表逻辑上的“真”与“假”或二进制当中的“1”和“0”来实现各种计算逻辑。而细胞本身的基因表达系统同样存在活跃 （表达） 或非活跃 （不表达） 两种状态，这使得我们可以从中抽象出“开/关”或者“0/1”的概念，通过人工设计基因线路的接入，以“生物逻辑门”为计算单元使细胞能够处理不同的生物信号，最终如同计算机一样能够开展“0/1”输出的布尔逻辑运算 （例如赋予细胞可进行多输入/多输出的复杂数字加法器、减法器电路） 。然而由于哺乳动物细胞基因调控本身的复杂性、现有可用人工基因线路的不足以及缺乏理论体系指导，导致现有复杂基因网络的构建只能依赖于设计者的经验、繁琐的设计和盲目的试错，最终严重制约着哺乳动物细胞生物计算的发展龙8long8。单细胞多层次复杂逻辑基因线的半加器和半减器。

　　为了突破上述的技术瓶颈并为复杂基因线路的设计和生物计算推出一套完整的理论体系，本研究首次提出了TriLoS设计原则，设计和利用“三态门电路”来取代传统的“逻辑门”来作为多层次基因调控网络的基本计算单元，创造出完全适用于细胞的“晶体管”，终于系统性实现了多种复杂的计算指令，并成功突破单细胞的计算极限。同时，进一步强化了一种以生物计算视角出发的疾病治疗思维，可以将不同代谢疾病的治疗程序简化成一种数学公式，然后通过TriLoS理论体系匹配出对应的细胞指令，开发治疗程序 （APP） ，从而为多种代谢性疾病定制出智能化的细胞治疗方案（图1）。

　　在数字电路里，相比于正常逻辑电路具有高（1）、低电平（0）两种状态，三态门多了第三种高电阻（Z）状态，该状态由电路的上游输入信号（B）控制。当B输入连接畅通时，电路由原有输入信号A 控制，输出0 或1，否则输出为高阻抗状态“Z”（图2）。利用多重三态门构建复杂电路时，可以保证多模块的灵活连接，同时确保信号传递的速度和效率。研究发现，细胞基因表达调控可抽象为三态门模式。例如从DNA经转录、翻译到最终生成蛋白的过程，转录调控（B）可以作为翻译调控（A）的上游控制通路，通过转录调控的开或关，影响翻译调控系统最终的三种状态 0、1 或者Z （不转录） 。而复杂的基因调控网路可以由多个三态门层加组合而成。

　　为了在哺乳动物细胞中实现“三态门”基因电路，需要响应同一输入信号的一对拮抗基因开关 （即NOT和BUF两种表达状态） 。由于这种表达逻辑需要具备一种“上下游”调控关系，多层次的“基因转录 （上游） / 蛋白翻译 （下游） ”基因网络能够最有效满足“三态门”的构建条件。因此，研究团队利用自己前期开发的人工翻译开关 （今年1月份发表于Cell Research题为Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells），与传统的基因转录调控系统进行巧妙结合，构建了Grazoprevir（Gra，输入A）控制的翻译开 （BUF） 或者关 （NOT） 作为“下游系统”，然后接入了Vanillic acid（VA，输入B）调控的转录系统作为“上游”基因开关 （开，IF1；关，IF0）（图2）。通过B转录开关 （IF1或IF0） 控制A翻译开关的关键元件 （BUF或NOT） 龙8long8，可以实现四种不同类型的三态门逻辑单元BUFIF1、NOTIF1、BUFIF0和NOTIF0（图3）。

　　为何“三态门”电路比较适合于基因线路的构建？值得一提的是，与电子工程不同，从基因表达结果的角度而言，无需严格区分“三态门”中的低电平（0）和高电阻（Z）两种状态。所以，我们可以将四种三态门单元BUFIF1、NOTIF1、BUFIF0和NOTIF0简化成以输入信号A或B为代表的数学公式 （） ，与上述的BUF（A）和 指令相结合，可以从中演变出所有16种布尔计算逻辑，可有效取代传统 “逻辑门” 来作为基本计算单元（图4）。

　　与传统以“逻辑门”作为基本逻辑单元的基因线路设计相比，“三态门”电路终于能够实现真正意义上模块化、最简化和系统性的“编程”。例如或门（OR），布尔计算公式为， 通过组装BUF（A; 模块 6) 和NOTIF1 (; 模块 2)，便可成功实现。类似的，对于一直困扰合成生物学家的异或门（XOR，），研究通过简单组合 NOTIF1（，模块2）和BUFIF0 （，模块3） 便可高效实现。而在传统的生物计算研究中，异或门转换为布尔公式语言为，这需要至少15次基因表达和9 次有效的信号传递，所需要的设计和基因调控网络十分复杂。因此，研究人员通过实验提出了以三态门作为基本计算单元，显著提高了哺乳动物细胞的“可编辑空间”，成功突破了细胞计算极限，这种设计原则被命名为TriLoS。

　　按照三态门设计，更加复杂的逻辑计算线路的构建可以通过并联或者串联更多的三态门来实现。上游基因控制线路需要完全正交，而最底层调控的正交性不会影响计算的精准 （图5A） 。因此，研究构建了第二组Gra响应的基因开关BUF2/NOT2 （图5B） ，与第一组Gra调控系统BUF1/NOT1并联独立运行并具有正交性 （图5C） 。该设计将受Gra诱导的二聚或互斥的基因元件NS3a(H1)/GNCR1 （二聚） 或者ANR/GNCR1 （互斥） 接入到人工合成的GEMS基因调控框架中。Gra的存在会促使作为受体的膜外信号接收部分相互亲和或者排斥，从而通过胞内JAK/STAT3信号通路，控制外源基因开关的开 （BUF2） 或者关 （NOT2） 。类似，通过VA 转录开关控制Gra翻译开关的关键元件NS3a(H1)/GNCR1/ANR，便将VA调控元件IF0和IF1与下游BUF和NOT连接起来，为构建复杂基因网络的 “工具箱”增加了四种新型三态门BUF2IF1 （模块7） 、NOT2IF1 （模块8） 、BUF2IF0 （模块9） 和NOT2IF0 （模块10） （图5D） 。

　　为了继续应对更加复杂多层次的逻辑计算，研究继续在转录上游层次接入基因层面的调控，接入第三个输入信号C，类似于基因调控的总控。依据TriLoS原则，输入B将成为其下游输入信号，这样就创建一个新的上游三态门（图6A）。在这里研究团队利用重组酶系统Cre （输入C） 构建了开关IF1(ON)和IF0(OFF)来控制下游基因的转录（B）或者翻译(A)（图6B），并且组装了另外8种新型三态门BUFIF1 （模块11和15） 、NOTIF1 （模块12和16） 、BUFIF0 （模块13和17） 和NOTIF0 （模块14和18）（图6）。

　　有了足够的三态门组件单元之后，研究人员通过简单映射布尔计算公式成功挑战原本高度复杂的基因网络计算系统。只需按照数学计算公式，选择合适的三态门进行并联或者串联拼接。例如具有二进制计算功能的半加器，可以用两个计算公式表示 和 Y=AB ”，其中 S 为和数，Y 为进位数。生物计算如布尔计算同理，将NOT1IF1（，模块2）和 BUF1IF0（，模块3）组装便实现和数S， 而进位数Y 则是单独的三态门BUF2IF1 (AB,模块 7)。两组模块进一步的并联便实现了复杂的半加器计算。而半减器计算的构建也相似（图7）。

　　为了挑战生物计算“天花板”，3输入2输出的全加器和全减器，研究人员借助了逻辑最小化工具：卡诺图 （K-map） 来简化真值表的数学计算方程，从而进一步精简化整个构架的复杂度，提高效率。经过K-map逻辑最小化后，全加和全减器和数S的布尔计算公式为S=。而这里恰巧为异或非门XNOR， 恰巧为异或门XOR， 而每一组件模块都已构建成功，只需按照公式串联或者并联。全加器的第2个输出信号进位数Y，龙8客户端登录全减器的借位同样可以通过拼接不同的模块而实现Y=BC+AC+AB和（图8）。至此三态门 TriLoS设计原则和设计方法用实验结果证明了其在构建复杂逻辑计算网络的高效性和有效性，并且成功突破单细胞内全加器和全减器这一研究瓶颈，解决了困扰智能细胞计算领域许久的难题。

　　赋予细胞新的计算能力之后，研究人员进一步将其用于疾病的精准化治疗。用复杂计算来映射疾病的不同状态，打造智能细胞，使其自主判断疾病的发病类型，从而指导产生合适的治疗蛋白，更加精准的实现疾病的分阶段、分层次、定制化治疗。以糖尿病为例，其分为I型、II型和II型晚期三个不同阶段，相应的需要两种治疗策略：胰高血糖素样肽1 （GLP-1） 或胰岛素 （INS） 。相比于之前的方法，一种智能细胞一次只能治疗一种状态。研究人员借助TriLoS开发了可进行3输入 （3种疾病状态） 、2输出 （2种治疗药物） 的复杂细胞计算，可以在不更换植入细胞的情况下追踪疾病状态，调整生产治疗药物，实现精准治疗。研究人员用布尔真值表来映射糖尿病的状态，用逻辑最小化转化为数学计算公式最终通过组合相应的三态门模块在细胞层次和小鼠体内都实现根据疾病的不同进程调整合适的治疗药物的精准治疗（图9）。

　　总而言之，该研究首次提出的基因电路“三态门”设计原则（TriLoS）以及设计、构建的多种基因调控三态门，为细胞计算领域提供了理论指导和技术创新，解决了现有研究中只能通过经验来盲目设计和反复试错的设计模式。最终不仅再次突破单细胞多层次计算的极限，更重要的是将生物计算的理念应用于智能细胞的精准治疗，利用此可编程细胞对复杂疾病进行数字逻辑化的治疗，从而让疾病治疗更加智能化、精准化和个性化。

　　本研究由西湖大学、浙江大学、之江实验室和国防科技大学合作完成，其中浙江大学“一带一路”国际医学院、浙江大学医学院附属第四医院、浙江大学国际健康医学研究院为本论文的第一通讯单位。浙江大学邵佳伟研究员，国防科技大学邱鑫源助理研究员，西湖大学博士研究生/前之江实验室工程专员张力航为该论文的共同第一作者。浙江大学邵佳伟研究员、国防科技大学朱凌云教授、之江实验室王慧研究专家和西湖大学解明岐研究员 （lead corresponding author） 为本论文的共同通讯作者。